基于PMA-ddPCR技术的发酵乳益生菌检测方法研究

作者：

本研究针对高产胞外多糖、可降胆固醇的植物乳杆菌 YZH81，通过全基因组测序与 SNP 分析，基于 gyrA 基因设计出菌株特异性引物和 MGB 修饰探针，建立并优化了碘化丙啶（PMA）- 微滴数字 PCR（ddPCR）检测方法；该方法可特异性区分 YZH81 与其他乳酸菌，能有效鉴别活菌与死菌，检测限低至，优于 qPCR，为发酵乳中特定益生菌菌株的质量控制与监管提供了快速、灵敏、特异的技术解决方案。

（PMA-ddPCR技术：结合PMA染料与ddPCR，实现活菌精准计数)

研究背景

发酵乳是全球流行的益生菌食品，常添加植物乳杆菌等益生菌，但益生菌功效具有严格的菌株特异性。

现有国家标准（如 GB 4789.35-2023）仅要求检测总乳酸菌数，无法实现菌株水平的识别与定量，难以保障产品功效与质量。

植物乳杆菌 YZH81 是实验室分离保存的优良菌株，具高产胞外多糖、降解胆汁盐、降低小鼠血清胆固醇等特性，需建立专属检测方法。

核心目标

设计 YZH81 的菌株特异性引物和探针。建立并优化 PMA-ddPCR 检测方法，实现发酵乳中 YZH81 的活菌定量。验证方法的特异性、灵敏度、抗干扰性及实际样品适用性。

关键实验结果

（1）菌株特异性验证

引物探针仅对植物乳杆菌YZH81产生特异性扩增，对植物乳杆菌WCFS1、ST-III、嗜酸乳杆菌NCFM等11株对照乳酸菌均无扩增信号，qPCR与ddPCR结果一致。

（2）灵敏度对比

（3）PMA浓度优化

最优PMA浓度为20μM：该浓度下，活菌DNA扩增不受影响，死菌DNA的扩增被有效抑制，Ct值显著升高、拷贝数大幅下降，进一步增加浓度无额外改善。问题：建立的PMA-ddPCR方法相比传统qPCR和平板计数法，在发酵乳检测中具有哪些优势？

答案：① 特异性更强：基于SNP设计的引物探针可实现菌株水平区分，而qPCR常无法区分近缘菌株，平板计数法无法鉴别菌株；② 灵敏度更高：检测限低至10^2 cfu/ml，优于qPCR的10^4 cfu/ml；③ 可鉴别活菌：结合PMA可抑制死菌DNA扩增，解决了PCR无法区分活菌死菌的痛点，平板计数法操作繁琐且耗时（24h以上）；④ 抗干扰性好：在发酵乳复杂基质及其他乳酸菌共存时仍能准确定量，RSD<25%，满足实际样品检测需求。

无

微米级线状蛋白聚集体的乳清蛋白颗粒制备方法与颗粒特性

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